Se qualcuno ancora di fronte il problema anche dopo le modifiche dette da @sridharnetha cercano di includere le linee sotto.
importante aggiungere UseAbsoluteHandlerPath = "false"
<ajax:AjaxFileUpload ID="AjaxFileUpload11" runat="server"
MaximumNumberOfFiles="3" AllowedFileTypes="txt,xls,xlsx,doc,docx,pdf"
Width="400px" UseAbsoluteHandlerPath ="false"
OnUploadComplete="OnUploadComplete"
OnClientUploadStart="UploadStart"
OnClientUploadCompleteAll="UploadComplete"
ClearFileListAfterUpload="true"
OnClientUploadError="UploadError"/>
Nel web.config
<httpHandlers>
<add verb="*" path="http://localhost/AjaxFileUploadHandler.axd"
type="AjaxControlToolkit.AjaxFileUploadHandler, AjaxControlToolkit" />
</httpHandlers>